Resource: Slovak Agricultural Library (SAL) - SAL Online Catalogue
Number of the records: 1
Modulačné účinky nanočastíc platiny na spermie králikov in vitro
Title Modulačné účinky nanočastíc platiny na spermie králikov in vitro = [Modulation effects of platinum nanoparticles on rabbit spermatozoa in vitro] / Lucia Dianová ; školiteľ Peter Massányi Author-s Dianová, Lucia, ; SPUPRA15 (Author)
Massanyi, Peter, ; SPUFBP30 (Thesis advisor)Corporation Slovenská poľnohospodárska univerzita (Nitra, Slovensko). Fakulta biotechnológie a potravinárstva. Ústav aplikovanej biológie Published 2025 Description 126 s. : garfy, ilustr., tab. ; 30 cm Notes V práci uvedený projekt - VEGA 1/0698/22, KEGA 035PU-4/2023, APVV-16-0289 a projekt APVV-21-0168. Súbežný názov prevzatý z databázy uis SPU . Bibliografia s. 101-116 . Resumé anglicky, slovensky . Doktorandská dizertačná práca (PhD.).- Ústav aplikovanej biológie FBP SPU v Nitre Subject-s nanočastice platina toxicita voľné radikály spermie pohyblivosť spermií životaschopnosť spermií kvalita ejakulátu králiky in vitro dizertácie Annotation Autorský abstrakt: ÚVOD: Spermia je unikátna vysokošpecializovaná samčia reprodukčná bunka, ktorej hlavnou funkciou je zabezpečenie prenosu otcovského genómu do samičieho reprodukčného systému, kde dochádza k jej splynutiu so samičou pohlavnou bunkou – vajíčkom, za vzniku zygoty. Na to aby dokázala spermia vykonávať tieto funkcie boli vyvinuté funkčné mechanizmy ktorými sú najmä pohyblivosť, podporná funkcia semennej plazmy ale tiež špecifická štruktúra DNA a ďalšie vlastnosti, ktoré napomáhajú týmto bunkám prekonať zmeny ktorým sú vystavené v samičom reprodukčnom systéme. Potvrdilo sa však, že funkčné atribúty spermií môžu byť do veľkej miery narušené vplyvom rôznych kontaminantov životného prostredia, ktoré sa v ňom vyskytujú v dôsledku činnosti človeka. Jedným z potenciálnych kontaminantov rôznych ekosystémov sú v súčasnej dobe nanočastice. Vďaka technologickému pokroku sa v súčasnosti používanie nanočastíc stáva čoraz častejším. Nanočastice sa používajú na dodávanie liečiv, pretože ich rozmery im umožňujú cirkulovať v tele a vstúpiť priamo do bunky. Antimikrobiálne vlastnosti sa čoraz viac využívajú pri výrobe zdravotníckych pomôcok, textílií, obalov potravín, kozmetiky a iných spotrebných produktov. Nanočastice poskytujú viacero výhod, no aspekty súvisiace s ich účinkami na živé organizmy a životné prostredie nie sú dobre známe. Pre ich veľmi malú veľkosť a schopnosť prekonávať biologické bariéry hrozí aj vysoké riziko kontaminácie ekosystému týmito látkami a preto je dôležité pochopenie mechanizmov ich pôsobenia a možných účinkov na živé organizmy na bunkovej úrovni. CIELE PRÁCE: Pri skúmaní modulačných účinkov nanočastíc platiny (Pt NP) na spermie králikov in vitro sme mali niekoľko čiastkových cieľov. Prvým cieľom bolo určiť vhodné koncentrácie Pt NP na základe predchádzajúcich výskumov a hodnotenia ich vplyvu na základné parametre kvality ejakulátu. Posudzovaná bola pohyblivosť a životaschopnosť spermií ako aj metabolická aktivita buniek a aktivita mitochondriálnych enzýmov. Druhým cieľom bolo zhodnotiť možné účinky Pt NP na oxidačný stav buniek, konkrétne na intracelulárnu produkciu superoxidových radikálov (•O2-). Tretím a posledným cieľom bola analýza molekulárnych markerov fragmentácie DNA kedy sme sledovali prítomnosť γH2AX – fosforylovanej formy histónu H2AX, ktorá signalizuje dvojvláknové zlomy DNA a obsah proteínového prekurzoru ProAKAP4, ktorý je špecifický pre spermie a podieľa sa na ich pohyblivosti, životaschopnosti a fertilizačnej schopnosti. MATERIÁL A METÓDY: Ejakuláty králikov, odobraté v reprodukčnom centre boli vystavené účinkom roztokov platinových nanočastíc v rôznych časových intervaloch pri teplote 37°C. Experimenty boli rozdelené do dvoch častí. V prvej časti experimentov boli roztoky nanočastíc platiny pripravené v deviatich rôznych koncentráciách (0,24 – 62,50 µg.ml-1 Pt NP). Následne bolo určené pH a osmolalita pripravených roztokov. Odobraté ejakuláty boli zriedené v pomere 1:9 s roztokmi Pt NP a vystavené ich účinkom počas 6 hodín pri 37°C. Analýza pohyblivosti spermií pomocou systému CASA prebiehala v časových intervaloch 0, 2, 4 a 6 hodín. Následne v terminálnom časovom intervale 6 hodín bol vykonaný MTT test na posúdenie mitochondriálnej aktivity spermií, Alamar Blue test na určenie metabolickej aktivity buniek a NBT test na zistenie obsahu intracelulárnych superoxidových radikálov. V druhej časti experimentov boli použité už len vybrané koncentrácie Pt NP 1, 30, 250 a 500 µg.ml-1 Pt NP. Ejakuláty boli zriedené v rovnakom pomere 1:9 s roztokmi Pt NP a vystavené ich účinkom po dobu 4 hodín pri 37°C. Analýza pohyblivosti spermií pomocou systému CASA prebiehala v časových intervaloch 0, 2 a 4 hodiny. V terminálnom časovom intervale 4 hodiny bol vykonaný MTT test na posúdenie mitochondriálnej aktivity spermií, NBT test na zistenie obsahu intracelulárnych superoxidových radikálov a proteínový marker pohyblivosti a životaschopnosti spermií ProAKAP4 bol stanovený pomocou metódy ELISA. Výsledky testov boli vyhodnotené pomocou jednofaktorovej analýzy variácií ANOVA a následným Dunettovým testom. Po 4 hodinách expozície Pt NP bola analyzovaná aj fragmentácia DNA imunofluorescenčnou metódou na sledovanie prítomnosti γH2AX – fosforylovanej formy histónu H2AX, ktorá signalizuje dvojvláknové zlomy DNA. Na vyhodnotenie bol použitý konfokálny laserový skenovací mikroskop Zeiss LSM 710. Finálne snímky boli spracované pomocou softvéru ImageJ. Štatistická analýza prebehla pomocou testov normality založené na Shapiro-Wilkovom teste kombinovanom s Kolmogorovov-Smirnovovým testom a rozdiely medzi skupinami boli stanovené pomocou Kruskal-Wallisovho testu. VÝSLEDKY: Z výsledkov našich experimentov môžeme konštatovať, že nanočastice platiny mali štatisticky významný negatívny vplyv na všetky sledované charakteristiky pohyblivosti spermií pričom pohyblivosť sa znižovala zo zvyšujúcou sa koncentráciou Pt NP. V prvej časti experimentov, kedy bola najvyššia použitá koncentrácia 62,50 µg.ml-1 Pt NP, nebol pozorovaný žiadny štatisticky významný vplyv na mitochondriálnu aktivitu, metabolickú aktivitu ani na produkciu intracelulárnych superoxidových radikálov. V druhej časti experimentov, s použitými koncentráciami Pt NP 1, 30, 250, 500 µg.ml-1, bola zhodne negatívne ovplyvnená pohyblivosť spermií so zvyšujúcou sa dávkou Pt NP vo všetkých sledovaných časových intervaloch. Mitochondriálna aktivita bola signifikantne znížená pri koncentráciách Pt NP 250 a 500 µg.ml-1. Totožný výsledok bol pozorovaný pri produkcii intracelulárnych superoxidových radikálov. Pokles v tomto prípade ale poukazuje skôr na vysokú letalitu buniek a nie na zníženie produkcie voľných radikálov. Obsah proteínového markera pohyblivosti a životaschopnosti spermií ProAKAP4 sa postupne znižoval s rastúcou koncentráciou Pt NP, čo poukazuje na negatívny vplyv nanočastíc na pohyblivosť a fertilizačnú schopnosť aj na molekulárnej úrovni. Počiatočné výsledky naznačovali pokles prítomnosti γH2AX, ktorý signalizuje dvojvláknové zlomy DNA, s rastúcou koncentráciou Pt NP. Po vynechaní spermií bez fluorescenčného signálu sa trend obrátil a prítomnosť γH2AX stúpla pri koncentráciách 250 a 500 µg.ml-1 Pt NP a tento výsledok pripisujeme zvýšenej letalite spermií rovnako ako v prípade produkcie voľných radikálov. Author’s abstract: INTRODUCTION: Spermatozoa is a unique, highly specialized male reproductive cell, whose primary function is to transfer the paternal genome to the female reproductive system, where it merges with the female gamete – the ovum – to form a zygote. To perform this function, spermatozoa rely on several mechanisms, including motility, the supportive role of seminal plasma, a specific DNA structure, and other properties that help them overcome challenges in the female reproductive system. However, it has been shown that the functional attributes of spermatozoa can be significantly disrupted by environmental contaminants resulting from human activity. One such contaminant is nanoparticles. With advancements in technology, the use of nanoparticles has become increasingly prevalent. Nanoparticles are used in drug delivery due to their size, which allows them to circulate through the body and enter cells directly. Their antimicrobial properties are also being leveraged in the production of medical devices, textiles, food packaging, cosmetics, and other consumer products. While nanoparticles offer several advantages, the impact of their effects on living organisms and the environment remains poorly understood. Due to their small size and ability to cross biological barriers, nanoparticles pose a significant risk of ecosystem contamination, making it important to understand their mechanisms of action and potential effects on living organisms at the cellular level. OBJECTIVES: The study aimed to investigate the modulatory effects of platinum nanoparticles (Pt NP) on rabbit spermatozoa in vitro, with several specific objectives. The first goal was to determine appropriate Pt NP concentrations based on previous research and assess their impact on basic ejaculate quality parameters. This included evaluating spermatozoa motility and viability, as well as assessing cell metabolic activity and mitochondrial enzyme activity. The second objective was to evaluate the effects of Pt NPs on the oxidative state of spermatozoa, particularly their intracellular production of superoxide radicals (•O2-). The third and final goal was to analyze molecular markers of DNA fragmentation by monitoring the presence of γH2AX, a phosphorylated form of histone H2AX that signals double-stranded DNA breaks, as well as the content of ProAKAP4, a protein precursor specific to spermatozoa involved in motility, viability, and fertilization potential. MATERIALS AND METHODS: Rabbit ejaculates, collected from a reproductive center, were exposed to platinum nanoparticle solutions at various time intervals at 37°C. The experiments were divided into two parts. In the first part, Pt NP solutions were prepared in nine different concentrations (0.24 – 62.50 µg.ml-1 Pt NP). The pH and osmolality of the solutions were determined, and ejaculates were diluted 1:9 with Pt NP solutions and exposed for 6 hours at 37°C. Spermatozoa motility was analyzed using the CASA system at time intervals of 0, 2, 4, and 6 hours. After 6 hours, the MTT test assessed mitochondrial activity, the Alamar Blue test measured metabolic activity, and the NBT test determined the presence of intracellular superoxide radicals. In the second part of the experiments, selected Pt NP concentrations (1, 30, 250, and 500 µg.ml-1) were used. Ejaculates were again diluted 1:9 with Pt NP solutions and exposed for 4 hours at 37°C. Spermatozoa motility was analyzed after 0, 2, and 4 hours, and after 4 hours, mitochondrial activity, superoxide radical levels, and ProAKAP4 protein content were assessed using ELISA. Test results were evaluated using one-way ANOVA and Dunnett's post-test. DNA fragmentation was analyzed after 4 hours using an immunofluorescence method to detect γH2AX. Confocal laser scanning microscopy (Zeiss LSM 710) was used for imaging, and images were processed using ImageJ software. Statistical analysis included normality tests (Shapiro-Wilk and Kolmogorov-Smirnov tests) and differences between groups were determined using the Kruskal-Wallis test. RESULTS: The results showed that Pt nanoparticles significantly negatively affected all spermatozoa motility parameters, with motility decreasing as the Pt NP concentration increased. In the first part of the experiments, the highest Pt NP concentration of 62.50 µg.ml-1 had no statistically significant impact on mitochondrial activity, metabolic activity, or the production of intracellular superoxide radicals. In the second part, using Pt NP concentrations of 1, 30, 250, and 500 µg.ml-1, spermatozoa motility was negatively impacted at all time points, with motility decreasing in response to higher Pt NP doses. Mitochondrial activity was significantly reduced at Pt NP concentrations of 250 and 500 µg.ml-1. A similar effect was observed to produce intracellular superoxide radicals, though the decrease was likely indicative of high cell lethality rather than reduced free radical production. ProAKAP4 protein levels, a marker of spermatozoa motility and viability, gradually decreased with increasing Pt NP concentration, indicating a negative effect on spermatozoa motility and fertilization ability at the molecular level. Initial results suggested a decrease in γH2AX presence, which signs DNA double-strand breaks, with higher Pt NP concentrations. However, after excluding spermatozoa without fluorescent signals, the trend reversed, with γH2AX presence increasing at higher Pt NP concentrations (250 and 500 µg.ml-1). This result is likely due to increased spermatozoa lethality and enhanced free radical production. Country Slovakia Language Slovak URL http://opac.crzp.sk/openURL?crzpSigla=spunitra&crzpID=55286 Copies 1, available for regular loan 0, in-library use only 1 Database Graduate theses 
book
Call number Dislocation Collection in study room Available VP-100182 Štúrova - záverečné práce in-library use only
Resource: Slovak Agricultural Library (SAL) - SAL Online Catalogue
Number of the records: 1