Počet záznamov: 1
Molekulové a oxidatívne mechanizmy kryokapacitácie
Názvové údaje Molekulové a oxidatívne mechanizmy kryokapacitácie = [Molecular and oxidative mechanisms of cryocapacitation] / Filip Benko ; vedúci záverečnej práce Norbert Lukáč Autor-i Benko, Filip, ; SPUFBP31 (aut.)
Lukáč, Norbert, ; SPUFBP30 (škol.)Korporácia Slovenská poľnohospodárska univerzita (Nitra, Slovensko). Fakulta biotechnológie a potravinárstva. Ústav aplikovanej biológie Vyd.údaje 2023 Rozsah 135 s. : grafy, ilustr., tab. ; 30 cm Poznámky Súbežný názov prevzatý z databázy uis SPU. V práci uvedený projekt - NUKLEUS 313011V387 Tvorba nukleových stád dojníc s požiadavkou na vysoký zdravotný status cestou využitia genomickej selekcie, inovatívnych biotechnologických metód a optimálneho manažmentu chovu . Bibliografia s. 103-135 . Resumé anglicky, slovensky . Doktorandská dizertačná práca (PhD.).- Ústav aplikovanej biológie FBP SPU v Nitre Predmet dizertácie Anotácia Autorský abstrakt: Aj napriek tomu, že kryoprezervácia bovinných spermií je v súčasnosti zvládnutá metodicky najlepšie, tak dochádza k poklesu kvality vzoriek po rozmrazení. Nízke teploty počas kryoprezervácie aktivujú kaskádu zmien, ktoré vedú k ireverzibilnému poškodeniu samčích gamét a znižujú tak ich fertilizačný potenciál. Jedným z nepriaznivých javov, ktorý vzniká v dôsledku kryogénneho poškodenia je aj kryokapacitácia. Tento proces napodobňuje priebeh prirodzenej kapacitácie, vedie k zmene morfologických, biochemických vlastností spermií a predčasnej spotrebe energie, ktorú spermatické bunky potrebujú pre úspešné oplodnenie. Cieľom našej práce bolo sledovať rozsah kryogénneho poškodenia a identifikovať rozdiely medzi in vitro vyvolanou kapacitáciou a chladom iniciovanou kryokapacitáciou v dôsledku kryogénneho poškodenia bovinných spermií. V rámci analyzovaných parametorv sme sa sústredili na zhodnotenie funkčnej aktivity, štrukturálnej integrity, kapacitačných zmien, oxidatívneho, genetického a proteomického profilu. Krátko po odbere boli vzorky (n=30) ejakulátu rozdelené do troch experimenálnych skupín, a to kontrolnej, in vitro kapacitovanej a kryoprezervovanej. Podiel motilných spermií bol zhodnotený pomocou počítačovo-asistovanej analýzy spermií (CASA). Mitochondriový membránový potenciál (MMP), membránová a akrozómová integrita boli vyhodnotené fluorescenčne, zatiaľ čo koncentrácia cyklického adenozín monofosfátu (cAMP) luminometricky. Index fragmentácie DNA bol analyzovaný prostredníctvom chromatín disperzného testu a farbenia anilínovou modrou, ktoré boli vyhodnotené mikroskopicky. Koncentrácia reaktívnych foriem kyslíka (ROS), vrátane peroxidu vodíka, hydroxylového radikálu ako aj celková antioxidačná aktivita (TAC) bola analyzovaná pomocou kombinovaného spektro-fluoro-luminometra. V prípade koncentrácie superoxidového radikálu bol aplikovaný NBT-test vyhodnotený spektrofotometricky. Analýza kapacitačných zmien bola uskutočnená prostredníctvom chlórtetracyklínového (CTC) farbenia pre fluorescenčnú mikroskopiu. Miera peroxidácie lipidov (LPO) bola vyhodnotená spektrofotometrickou kvantifikáciou malondialdehydu (MDA) a na zhodnotenie progresu oxidácie proteínov sme využili klasickú DNPH (2, 4 – dinitrofenylhydrazín) metódu kde bola koncentrácia proteínových karbonylov taktiež vyhodnotená spektrofotometricky. Úroveň expresie génov asociovaných s kapacitáciou (katiónové kanáliky spermií - CatSper1 a 2, sodíkovo-bikarbonátový kotransportér - NBC a proteínkináza A - PKA) bola kvantifikovaná prostredníctvom qRT-PCR, zatiaľ čo na zhodnotenie proteínovej expresie vybraných génov sme využili techniku Western-blot. Z výsledkov sme zhodnotili, že v rámci kryoprezervovaných bovinných spermií došlo k signifikantnému poklesu (P<0,0001) motility a MMP, rovnako štatisticky významnému poklesu (P<0,05; P<0;01) koncentrácie cAMP oproti in vitro kapacitovanej a kontrolnej skupine. Z hľadiska štrukturálnej integrity došlo rovnako k signifikantnému poklesu (P<0,01; P<0,0001) membránovej a akrozómovej integrity a významnému nárastu (P<0,0001) počtu nekrotických buniek v kryoprezervovanej skupine. Chromatín disperzný test a farbenie anilínovou modrou poukazovali na signifikantný nárast (P<0,0001) fragmentácie DNA v kryoprezervovanej skupine v porovnaní s ostatnými. Zhodnotenie priebehu kapacitácie poukazovalo predovšetkým na štatistický nárast (P<0,01; P<0,0001) buniek s akrozómovou reakciou (CTC vzor AR) v kryoprezervovanej skupine oproti kontrole aj kapacitovanej skupine. Zmeny v oxidatívnom profile kryoprezervovaných bovinných spermií vykazovali signifikantný nárast (P<0,0001) generácie ROS, peroxidu vodíka a hydroxylového radikálu, pričom v prípade produkcie superoxidového radikálu sme zaznamenali významný pokles (P<0,001) oproti kapacitovanej skupine. Oxidatívne poškodenie sa prejavilo výrazným zvýšením (P<0,0001) úrovne LPO a oxidácie proteínov ako aj poklesom (P<0,05) TAC v kryoprezervovanej skupine. Z pohľadu expresie vybraných génov došlo k signifikantnému poklesu génovej expresie CatSper1 (P<0,001) a CatSper2 (P<0,0001) v kryoprezervovanej skupine oproti kapacitovanej a kontrolnej skupine. V prípade PKA a NBC neboli zaznamenané signifikantné rozdiely. Výsledky proteínovej expresie potvrdili výrazný pokles CatSper1 (P<0,01; P<0,0001), CatSper2 (P<0,0001), PKA (P<0,05) ako aj NBC (P<0,01) v kryoprezervovanej skupine. Na základe našich zistení môžeme konštatovať, že kryokapacitácia je sprievodným javom kryoprezervácie bovinných spermií čo nepriaznivo ovplyvnilo takmer všetky sledované parametre, ktoré by mohli v budúcnosti slúžiť ako markery kryogénneho poškodenia. Author’s abstract: Despite the fact that cryopreservation of bovine spermatozoa is currently managed very well, the quality of thawed samples can be affected. Low temperatures during cryopreservation activate a cascade of changes that lead into irreversible damage of male gametes and reduce their fertilization potential. One of the adverse effect of cryogenic damage is cryocapacitation. This process mimics the course of natural capacitation, leading to changes in morphology, biochemical properties and premature consumption of energy that sperm cells need for a successful fertilization. The aim of our work was to determine the extent of damage and to identify the differences between in vitro induced capacitation and cold-initiated cryocapacitation due to cryogenic damage of bovine spermatozoa. Within the analyzed parameters, we focused on the functional activity, structural integrity, capacitation status, oxidative, transcriptomic and proteomic profile. The samples were divided into three experimental groups, control, in vitro capacitated and cryopreserved group. The proportion of motile spermatozoa was evaluated by the Computer-Assisted Sperm Analysis (CASA) method. Mitochondrial membrane potential (MMP), membrane and acrosome integrity, and oxidative profile were observed fluorescently, while the concentration of cyclic adenosine monophosphate (cAMP) was evaluated luminometrically. The concentration of reactive oxygen species (ROS) including hydrogen peroxide, hydroxyl radical as well as total antioxidant capacity (TAC) were analyzed by using the Glomax Multi+ combined spectro-fluoro-luminometer. In the case of superoxide radical concentration the NBT-test was applied and evaluated spectrophotometrically. Analysis of capacitation changes was performed by chlortetracycline (CTC) staining for fluorescent microscopy. The level of lipid peroxidation (LPO) was evaluated by the spectrophotometric quantification of malondialdehyde (MDA) and for the assessment of protein oxidation we used a traditional DNPH (2,4-dinitrophenylhydrazin) method where the concentration of protein carbonyls was also evaluated spectrophotometrically. The expression of capacitation associated genes (cation channels of sperm - CatSper1 and 2, sodium-bicarbonate cotransporter - NBC and protein kinase A - PKA) was quantified by real-time PCR, while the Western-blot was used for the evaluation of protein expression of these genes. From the collected results, we observed that there was a significant decrease (P<0.0001) in the motility, MMP and a significant decrease (P<0.05; P<0.01) in the concentration of cAMP following comparison of the cryopreserved group with the in vitro capacitated group as well as the control. In the case of the structural integrity, there was also a significant decrease (P<0.01; P<0.0001) in the membrane and acrosome integrity and a significant increase (P<0.0001) in the number of necrotic cells in the cryopreserved group. The evaluation of capacitation changes reveal a significant increase (P<0.01; P<0.0001) of cells with acrosome reaction in the cryopreserved group against the control and capacitated group. Changes in the oxidative profile of cryopreserved spermatozoa showed a significant increase (P<0.0001) in the generation of ROS, hydrogen peroxide and hydroxyl radical, while in the case of superoxide radical we recorded a significant decrease (P<0.001) compared to the capacitated group. Oxidative damage was manifested by a significant increase (P<0.0001) in the level of LPO and protein oxidation as well as by a significant decrease (P<0.05) in TAC in the cryopreserved group. From the transcriptomic point of view, the expression of capacitation-associated genes, there was a significant decrease in the gene expression of CatSper1 (P<0.001) and CatSper2 (P<0.0001) in the cryopreserved group when compared to the capacitated and control group. No significant differences were visible in the case of PKA and NBC genes. The results of protein expression confirmed a significant decrease in CatSper1 (P<0.01; P<0.0001), CatSper2 (P<0.0001), PKA (P<0.05) as well as NBC (P<0.01) in the cryopreserved group. Based on our findings, we can conclude that cryocapacitation is an accompaying phenomenon of cryopreservation, which negativelly affected almost all monitored parameters that could be used as physical markers of cryogenic damage of bovine spermatozoa in the future. Krajina Slovensko Jazyk dok. slovenčina URL http://opac.crzp.sk/openURL?crzpSigla=spunitra&crzpID=43888 Počet ex. 1, z toho voľných 0, prezenčne 1 Báza dát Kvalifikačné práce 
kniha
Signatúra Dislokácia Umiestnenie Voľné VP-97943 Štúrova - záverečné práce len prezenčne
Počet záznamov: 1